通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆

經(jīng)過3～4輪的篩選后，應(yīng)該能夠富集到能與受體特異性結(jié)合的噬菌體群體。通常而言，在后幾輪的篩選中，每次獲得的噬菌體總量都會(huì)增加，但是單就這個(gè)現(xiàn)象并不一定能說明已經(jīng)篩選到了受體特異性結(jié)合的肽段。能與靶分子非特異性結(jié)合或者能與篩選基質(zhì)的噬菌體克隆也會(huì)造成這一現(xiàn)象。噬菌體ELISA可以說是zui靈敏的鑒定所獲取的噬菌體克隆結(jié)合特異性的方法之一。受體被包被在各孔中，與之結(jié)合的噬菌體通過辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗M13噬菌體抗體檢測。只含有捕獲抗體或者牛血清白蛋白的孔用來作為陰性對照。作為競爭性結(jié)合物的已知的配體可以加入到噬菌體中來分辨競爭性肽和非競爭性肽。值得注意的是，這個(gè)實(shí)驗(yàn)所用的條件是為了使檢測的靈敏度zui大化，而不是基于所展示肽段的內(nèi)在親和性來分辨各個(gè)克隆的。多價(jià)結(jié)合、表達(dá)量的差異以及每個(gè)肽段對蛋白酶的敏感性都將很大地影響信號(hào)的強(qiáng)弱。
通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆
另一個(gè)用來從富集的噬菌體群體中發(fā)現(xiàn)受體特異性克隆的方法是用受體作為探針來檢測克隆黏附。這是通過將感染了所篩選的噬菌體的細(xì)菌細(xì)胞于LBamp/kan瓊脂糖乎板上培養(yǎng)，其中培養(yǎng)基含有與液相擴(kuò)增噬菌體相同濃度的葡萄糖和阿拉伯糖。將從細(xì)胞中排出的噬菌體轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上后，用標(biāo)記了的靶分子探測（通常是放射性標(biāo)記）。此方法的靈敏度要低于噬菌體ELISA，但是它提供了一個(gè)快速的大規(guī)模分析克隆的方法，并且對于發(fā)現(xiàn)高親和力的序列可能有作用。
通過噬菌體ELISA鑒定得到的噬菌體克隆
通過對陽性克隆的p8V5載體的插入DNA片段測序，將可以推演出對應(yīng)的肽段序列。

[器材和試劑]
● 辣根過氧化物酶標(biāo)記抗M13噬菌體抗體（HRP-conjugated anti-M13 antibody）（Amersham Biosciences）
● ABTS顯色緩沖液[50mmol/L檸檬酸，用NaOH調(diào)節(jié)pH至4．0，0．22mg/m1 2，2，-連氮基-雙（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）；使用之前加入0．05％的雙氧水]
● Q1agenPlasmidMini Kit試劑盒（Q1agen）
● p8V5反向測序引物（5，-TGAGGCTT-GCAGGGAGTC-3，）

[方法]
1．從噬菌體滴定平板挑取單克隆，并接種到5mlSOPamp/glu培養(yǎng)基中。于37℃振搖培 養(yǎng)直至OD600值達(dá)到0.5。
2．加入VSC-M13輔助噬菌體（1X109pfu），于37℃靜置孵育30分鐘。
3．加入50tzl 20％阿拉伯糖溶液和5ul 20mg/ml卡那霉素溶液。于37℃振搖培養(yǎng)過夜。
4．于3400r/min轉(zhuǎn)速（臺(tái)式離心機(jī)） 離心細(xì)菌15分鐘，將含有噬菌體的上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中。
5．按照實(shí)驗(yàn)方案6．5所述，將受體固定在96孔酶標(biāo)板中。每孔中加入50rdPBS/1％BSA和50ul噬菌體上清，于4℃孵育2小時(shí)。
6．使用PBS洗板5次。用PBS/1％BSA溶液，按1：5000比例稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記 抗M13噬菌體抗體，并于每孔中各加入50/11稀釋液。于4℃孵育1小時(shí)。
7．使用PBS洗板5次。于每孔中加入100ul ABTS顯色緩沖液，室溫孵育直至顏色顯現(xiàn)。用酶標(biāo)儀測定405 nm波長時(shí)的吸光度。
8．按照廠商說明書，用QiagenPlasmidMiniKit試劑盒抽提在ELISA反應(yīng)中顯陽性的噬菌體雙鏈DNA。按雙脫氧測序法ti4]使用p8V5反向測序引物測定DNA序列。