病毒RNA快速提取試劑盒的應(yīng)用

背景[1-3]

病毒RNA快速提取試劑盒是一種基于離心柱法從含病毒的血漿、血清、體液、拭子及細胞及其培養(yǎng)上清、組織等樣品中安全、快速、便捷、穩(wěn)定、高效、高質(zhì)量地抽提長度大于200個核苷酸(nucleotide,nt)的病毒RNA的試劑盒。抽提獲得的大于200個核苷酸的病毒RNA樣品(可能同時含有樣品中的其它RNA)可以用于各種常規(guī)用途。

本試劑盒抽提得到的病毒RNA可用于qRT-PCR、反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、qPCR、Northern、點雜交(Dot Blot)、純化mRNA、體外翻譯、RNase protection assay、cDNA克隆等下游實驗；也可用于基因表達芯片分析(microarray)、高通量測序(high throughput sequencing)等對RNA質(zhì)量要求較高的情況。

病毒RNA快速提取試劑盒

樣品在裂解液中迅速裂解，釋放出總RNA，然后讓RNA特異性地結(jié)合到純化柱上，而蛋白質(zhì)等其它組分通過高速離心被有效去除，再通過3次洗滌充分去除非特異性結(jié)合的蛋白、鹽等雜質(zhì)，后用洗脫液將高純度的RNA洗脫下來。

本試劑盒適用于含病毒的血漿、血清、體液、拭子及細胞及其培養(yǎng)上清、組織等樣品中病毒RNA的抽提，為提高病毒RNA的提取量，建議自備carrier RNA。Carrier RNA一方面可以提高微量病毒RNA在純化過程中與純化柱的結(jié)合效率和洗脫效率；另一方面可以降低被可能存在的痕量殘留RNase降解的風(fēng)險。Carrier RNA在病毒含量較少的情況下效果更為明顯。Carrier RNA推薦Carrier RNA(病毒RNA等抽提用)。

病毒RNA快速提取試劑盒的應(yīng)用

用于用于病毒核酸快速提取的新型磁性納米材料的設(shè)計、制備和應(yīng)用研究

通過合成不同表面化學(xué)修飾的四氧化三鐵磁性顆粒,并分析磁性顆粒與核酸（DNA和RNA）之間的吸附與解吸附性質(zhì),進而建立基于磁性顆粒的病毒核酸提取方法,結(jié)合實時熒光定量PCR技術(shù),實現(xiàn)病毒的靈敏、快速檢測。

主要內(nèi)容及工作結(jié)果歸納如下：

（1）利用高溫裂解法和熔劑熱法合成粒徑大小分別為10和200 nm左右的四氧化三鐵磁性顆粒。在此基礎(chǔ)上,首先利用四乙氧基硅烷修飾10 nm四氧化三鐵磁性納米顆粒,合成二氧化硅包裹的磁性顆粒（Silica-coated magnetic particles,SMPs）,從而改善磁性顆粒在水溶液中的分散性,獲得表面帶有負電的磁性顆粒；另外,依次利用四乙氧基硅烷和γ-氨丙基三乙氧基硅烷修飾200 nm的四氧化三鐵磁性顆粒,合成氨基硅烷化磁性顆粒（Aminosilane-modified magnetic particles,AMPs）;后,利用羧基苯硼酸對10 nm四氧化三鐵磁性顆粒進行功能化修飾,獲得羧基苯硼酸修飾的磁性納米顆粒（Carboxyphenylboronic acid-functionalized magnetic particles,CPBA-MNPs）。磁性顆粒的表征結(jié)果表明,成功合成了上述不同表面化學(xué)修飾的磁性顆粒,其表面基團分別為：羥基、氨基和苯硼酸。

（2）以鮭魚精DNA和大腸桿菌RNA為材料,分析SMPs與核酸的吸附和解吸附性質(zhì)。結(jié)果表明：在低濃度異硫氰酸胍（1.0 M）溶液中,SMPs對核酸的吸附量大；Langmuir吸附等溫線擬合分析表明,1 mg SMPs對DNA和RNA的大吸附量分別為10.6μg和7.6μg；溶液的酸堿性質(zhì)對于吸附量具有較大的影響,在酸性條件下,能夠顯著降低核酸與SMPs間的靜電斥力,從而提高核酸吸附量；乙醇與異丙醇的加入能夠降低吸附體系的極性,從而增加核酸的吸附量。CPBA-MNPs與核酸之間的吸附與解吸附性質(zhì)分析結(jié)果表明：二價陽離子（如Ca2+、Mg2+）以及乙醇的加入能夠顯著提高核酸吸附量；在酸性條件下,RNA的吸附量大于在堿性條件下的吸附量；由于苯硼酸分子與RNA之間形成了可逆的環(huán)酯結(jié)構(gòu),通過加入順式雙醇類似物可有效地將RNA洗脫,Tris-EDTA溶液（50 mM Tris,5 mM EDTA,pH 8.8）的洗脫效率分別為75.6±7.6%（DNA）和60.1±5.9%（RNA）。

（3）在研究SMPs與核酸吸附與解吸附性質(zhì)的基礎(chǔ)上,以SMPs為吸附材料,分析提取血清中乙肝病毒和丙肝病毒核酸的可行性,以及利用實時熒光PCR/RT-PCR實現(xiàn)對乙肝病毒和丙肝病毒的快速檢測。結(jié)果表明：在蛋白酶K和1.0 M異硫氰酸胍存在的條件下,56℃水浴15 min能夠有效的釋放HBV和HCV的核酸；通過加入1倍體積乙醇,能夠有效的分離提取HBV和HCV的核酸；建立HBV和HCV的實時熒光PCR/RT-PCR檢測方法和定量標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠有效的應(yīng)用于HBV和HCV的檢測與定量。利用實時熒光PCR/RT-PCR技術(shù)定量分析SMPs的核酸回收效率分別為30±11.1%（HBV）和34±7.3%（HCV）,高于已報道的商業(yè)試劑盒的提取效率。此外,將上述方法應(yīng)用于進出北京口岸旅行人員的乙肝與丙肝病毒的檢測與分析,結(jié)果表明,SMPs方法和實時熒光PCR/RT-PCR方法能夠有效地用于出入境人員的病毒核酸提取和分析工作中。

（4）以SMPs為固相吸附載體,建立提取植物病毒核酸的方法,并應(yīng)用于植物病毒（南芥菜花葉病毒、百合無癥病毒）及類病毒（啤酒花矮化類病毒、葡萄黃斑類病毒1）的檢測。利用體外轉(zhuǎn)錄合成覆蓋實時熒光RT-PCR擴增區(qū)的RNA標(biāo)準(zhǔn)品,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,標(biāo)準(zhǔn)曲線覆蓋6-7個數(shù)量級,并且-低檢測限為100拷貝／反應(yīng)。為評價SMPs方法的核酸提取效率,將體外轉(zhuǎn)錄合成的RNA標(biāo)準(zhǔn)品加入到植物樣品裂解液中,分別利用SMPs方法、TRIzo1和RNeasy Plant mini kit回收提取。結(jié)果表明,在回收百合葉片樣品中的核酸時,SMPs方法與兩種商業(yè)試劑盒相等,無明顯差異；而當(dāng)回收葡萄葉片中的核酸時,SMPs方法的回收效率高商業(yè)試劑盒2-3倍。利用SMPs方法分別提取15株感染LSV和15株感染ArMV的百合樣品,利用實時熒光RT-PCR進行檢測。對于檢測ArMV,SMPs方法與其他方法沒有明顯統(tǒng)計學(xué)上的差異,而對于檢測LSV,結(jié)果略有不同。同TRIzo1相比,SMPs方法具有相同的病毒載量數(shù)量級,而與RNeasy Plant mini kit相比,SMPs方法的平均病毒載量低0.51oglo。利用SMPs方法提取19株葡萄樣本的核酸,采用實時熒光RT-PCR方法進行HSVd和GYSVd-1篩查。