聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）簡稱PCR技術(shù)，是近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，由于其可使特定DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加至可檢測范圍，故成為基因診斷的重要方法。在PCR基礎(chǔ)上衍生的一些擴(kuò)增技術(shù)已用于基因突變的診斷。目前單基因疾病PGD所用的方法主要是基于PCR技術(shù)通過檢測單細(xì)胞靶基因的數(shù)目及結(jié)構(gòu)有無異常加以診斷。

  （一）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
  PCR實(shí)際上是在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)?；驹硎牵河靡粚押塑账徭溩鲆?，引導(dǎo)DNA聚合酶在引物識別位點(diǎn)之間兩條互補(bǔ)鏈上進(jìn)行DNA合成，經(jīng)過模板變性、退火及延伸三步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，多次循環(huán)可使特定DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加至2×l0（6一7）拷貝。
    單細(xì)胞PCR無需抽提DNA，經(jīng)過變性前處理步驟后，即進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)。與經(jīng)典PCR相比，其優(yōu)點(diǎn)是無需制備DNA，節(jié)省時(shí)間，從獲得樣本、PCR反應(yīng)到出結(jié)果只需幾個(gè)小時(shí)左右。但由于單細(xì)胞PCR的模板量極低，僅1–2拷貝，故PCR體系必須具備下列條件：①對模板擴(kuò)增的忠實(shí)性好；②方法穩(wěn)定；③無非特異性擴(kuò)增；④擴(kuò)增的靈敏度高。目前用于PGD的PCR方法主要有以下幾種：
    1．巢式PCR  由于單細(xì)胞中可檢測的僅l一2個(gè)拷貝的基因序列。為了既不影響特異性又獲得較大的敏感性，巢式引物被應(yīng)用。巢式PCR設(shè)置二步PCR，只有初級PCR中特異的擴(kuò)增片段才可能被二級引物擴(kuò)增，可減少引物與模板非特異性位點(diǎn)的復(fù)性、引物二聚體的形成以及非特異背景產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高了擴(kuò)增特異性，而且增加了zui終產(chǎn)物量。
    2．多重PCR  如果與疾病相關(guān)的基因十分龐大，如杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD），有2 OOO多kb長。這些基因常多處發(fā)生缺失或突變，而且這些改變發(fā)生在相鄰十至數(shù)百個(gè)kb的距離，超出了PCR技術(shù)所能擴(kuò)增的有效長度，對此，可采用多重PCR，既在同一試管中加人多對引物，擴(kuò)增同一模板的幾個(gè)區(qū)域。目前報(bào)道多重PCR反應(yīng)zui多可同時(shí)擴(kuò)增12條區(qū)帶。
    3．熒光PCR  指熒光標(biāo)記的寡核苷酸引物。PCR產(chǎn)物用激光分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，從產(chǎn)物大小到核苷酸序列都能夠被準(zhǔn)確分析。由于不同的熒光分子在激光激發(fā)下有不同波長，在片段分析結(jié)構(gòu)系統(tǒng)中，相同大小的不同產(chǎn)物可以被區(qū)分開。其敏感性優(yōu)于普通PCR千倍。準(zhǔn)確性可達(dá)l一2bp。對于單細(xì)胞35–4O個(gè)循環(huán)就可以產(chǎn)生足夠量的產(chǎn)物，不僅減少了散在的、非特異的污染，而且縮短診斷時(shí)間?，F(xiàn)該方法已廣泛用于PGD。
    4．熒光定量PCR  該技術(shù)融匯了PCR和DNA探針雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)體系中，不僅有兩條普通的引物，還有一條熒光標(biāo)記探針。這條探針的5’和3’端分別標(biāo)記了熒光報(bào)告基團(tuán)（R）和熒光淬滅基團(tuán)（Q）。當(dāng)探針保持完整時(shí)，無熒光發(fā)出。PCR開始后，隨著鏈的延伸，Taq酶將熒光探針切斷，釋放出熒光信號，且信號的強(qiáng)弱與PCR的產(chǎn)物數(shù)量成正比，檢測出前者可計(jì)算出后者，從而獲取DNA模板的準(zhǔn)確結(jié)果。該技術(shù)在*閉管的情況下進(jìn)行，無需凝膠電泳，通過特殊探頭直接探測PCR過程中熒光信號的變化，解決了常規(guī)PCR不能定量及擴(kuò)增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽性、操作復(fù)雜等問題，減少污染的可能性，提高了診斷的效率。
    5．原位PCR  此技術(shù)由HaSSe等于1990年建立，即在固定于同一載玻片上的同一個(gè)單細(xì)胞上，先用PCR原位擴(kuò)增，再用FISt{檢測，目前PGD中應(yīng)用該方法，PCR的有效率為65％，F(xiàn)ISI–I達(dá)85％。遺憾的是ADO較常規(guī)PCR高。但這種新方法有效的把原位雜交技術(shù)的細(xì)胞定位能力與PCR擴(kuò)增的所有潛在敏感性結(jié)合起來，相信隨著引物設(shè)計(jì)及熒光PCR與原位PCR有效的結(jié)合，其不足會得到克服，該方法也許會成為PGD的未來。

    6．免疫PCR  是PCR法與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法的融合技術(shù)，利用了PCR的大量擴(kuò)增能力和抗原抗體反應(yīng)的特異性。其原理是將目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物用生物素標(biāo)記，檢測突變的特異性探針用地高辛標(biāo)記，二者經(jīng)變性退火處理后加到含抗生物素的酶標(biāo)板內(nèi)，通過顯色來鑒定突變是否存在。根據(jù)顯色深淺可做定量分析。該法已用于囊性纖維病基因突變的檢測。
    7．等位基因特異性擴(kuò)增  在設(shè)計(jì)引物時(shí)，根據(jù)已知突變位點(diǎn)的特征，在引物3’端或中間設(shè)計(jì)一錯(cuò)配堿基，使之僅能與突變型或野生型基因互補(bǔ)，而只擴(kuò)增相對應(yīng)的突變型或野生型基因。主要用于點(diǎn)突變導(dǎo)致的遺傳病的檢測。其優(yōu)點(diǎn)是只需一步PCR，而無需電泳和標(biāo)記，擺脫了分子生物學(xué)方法中必經(jīng)電泳的現(xiàn)象。在相互競爭的突變型和野生型引物中，分別采用不同熒光染料標(biāo)記擴(kuò)增的DNA，可直接對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行判讀。另外使用具有特定酶切位點(diǎn)的內(nèi)嵌引物，也可提高產(chǎn)物特異性和產(chǎn)量，DNA擴(kuò)增后用酶切割，由酶切產(chǎn)物可明確是否有基因突變，該法已應(yīng)用于單個(gè)精子的DNA分析。